L'agent Phil Coulson, qui a survécu à la blessure que lui a infligé Loki avant la bataille de New-York, retourne au sein de l'organisation mondiale du maintien de l'ordre, le SHIELD (Strategic Homeland Intervention, Enforcement and Logistics Division). Il réunit alors une équipe d'agents, extrêmement bien entraînés, afin de s'attaquer aux affaires qui n'ont pas encore été classées ayant trait à l'étrange et à l'inconnu.

Cependant, ils vont vite se retrouver confrontés à une puissante organisation nommée « Centipede», qui a conçu un engin, ressemblant à un mille-pattes (« Centipede » en anglais) rassemblant les différentes technologies de super-pouvoirs comme le sérum de Captain America, les rayons Gamma de Hulk, des technologies Aliens et le gène Extrémis vu dans Iron Man 38.

Après avoir démantelé « Centipede » qui n'était qu'une branche de l'HYDRA, l'agent Coulson doit reconstruire le SHIELD sous ordre de son ancien directeur, Nick Fury. Ce dernier devient alors le directeur du nouveau SHIELD et doit désormais combattre HYDRA avec son équipe.